Evolutionary states and trajectories characterized by distinct pathways stratify patients with ovarian high grade serous carcinoma
杂志：Cancer Cell
作者单位：赫尔辛基大学
一项前瞻性、纵向、多区域 DECIDER 研究中，收集148名HGSC患者，510份临床样本进行全基因组测序。结果揭示HGSC具有三种进化状态，它们在基因组学、信号通路和形态表型方面具有不同的特征，并与治疗反应有显著的关联。通路分析表明了这三种状态之间的两种进化轨迹。用五个肿瘤类器官系和三种PI3K抑制剂进行体外实验验证：结果显示阿培利司靶向富含PI3K/AKT通路的肿瘤。对来自多个解剖部位的样本进行的异质性分析表明，原发部位样本的独特克隆比转移性肿瘤或腹水样本多70%。总之，通过这些分析和可视化方法，利用纵向、多区域队列数据进行综合肿瘤进化分析，确定患者亚型。
一、研究背景
卵巢癌严重威胁女性健康，在全球范围内，卵巢癌是女性第八大常见恶性肿瘤，同时也是最为致命的妇科恶性肿瘤，致死率位于三大妇科肿瘤（卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌）首位。高级别浆液性卵巢癌（HGSC）是最常见的上皮性卵巢癌亚型。HGSC的中位潜伏期超过10年，通常在确诊时已处于转移状态。因此，未经治疗的HGSC肿瘤经历了基因组学上不同克隆的扩增，导致疾病高度异质性，并已包含肿瘤进展和耐药性的驱动因素。导致尽管80%的 HGSC患者对目前的标准疗法反应良好，但几乎所有患者在确诊后几年内都会复发，五年生存率低于40%。
二 、研究路线图
三、研究结果
1 DECIDER 队列：构建系统发育树并在亚克隆分辨率下评估克隆成分
研究人员前期招募了55名患者，并收集了214份样本，进行免疫组化切片以及全基因组测序，测序发现15102个突变，除TP53在所有患者中都发生突变外，其他患者的突变模式各不相同，其他显著突变（P<0.001）的基因有BRCA2（11%）、AGAP6（7%）、MGA（9%）和RB1（5%）。利用GenomeSpy工具，发现大约一半的HGSC肿瘤表现出同源重组缺陷（HRD）。此外，CCNE1在15%-20%的HGSC患者中扩增，并预测HGSC的五年无进展生存。GenomeSpy可视化显示，高CCNE1扩增与决策队列中低HRD相关。
2 系统发育分析显示HGSC患者内部和患者之间具有高度不同的克隆组成
本研究开发了一个可视化界面，能够显示比较相同或不同时间点从多个解剖地点获得的样本的克隆组成。如图患者EOC742可以观察到腹水和大网膜中获得的诊断样品的克隆组成包括两个几乎相等比例的共享亚克隆，以及独特的亚克隆。在第二个进展阶段获得的腹水样本显示，在治疗过程中早期采集的样本中未检测到的克隆组成和两个亚克隆完全不同。在处理前，样品的克隆组成显示出高度的亚克隆异质性。患者EOC153可以观察到一个罕见的克隆组成完全改变影响多个组织的例子，该患者对一线治疗有完全反应，生存期为41个月。三个样本在新辅助化疗（NACT）后的克隆组成与诊断时完全不同。诊断样品的克隆组成彼此非常相似，而NACT处理的样品彼此非常不相似。
3 肿瘤异质性的量化处理，使得HGSC患者聚集成具有独特时间顺序的进化状态
由于 HGSC 肿瘤表现出高度患者特异性的克隆复杂性和分化，研究人员根据克隆复杂性和分化对患者进行了聚类。55名患者被分为三种不同的集群，集群1克隆数量少（1.79），克隆分化程度高（1.66），称为“进化状态”；集群2克隆数最多（3.66），克隆分化程度最低（1.23），称为“维持状态”；集群3克隆数最多（2.43）克隆分化程度最高（2.63），称为“适应状态”。为了检查PFI和OS的相关性是否在独立的患者样本中重现，研究人员使用了来自93名HGSC患者的296份肿瘤样本的数据进行验证，同时为了最大限度地提高生存分析的效率，研究人员将发现队列和验证队列合并，结果显示，与来自进化和适应状态的患者相比，来自维持状态的患者表现出最短的复发时间和最低的生存率（p = 0.008）。同样在OS分析中，处于维持状态的患者具有最差的存活率（p = 0.047），进化状态的患者具有最好的存活率。
4 不同进化状态下的细胞组成不同，与肿瘤形态相关
在适应状态下的特点是癌细胞数量最多，成纤维细胞数量最少，而免疫成分在三种状态下的数量同样较少。研究人员假设癌症/成纤维细胞比率反映了肿瘤的生长模式，对高成纤维细胞肿瘤和低成纤维细胞肿瘤进行染色切片，发现低成纤维细胞肿瘤通常在形态学上主要表现出SET型（实性、内膜样和移行细胞样）和具有少量基质成分的扩张型乳头状生长模式；高成纤维细胞肿瘤表现出破坏性生长，其形式为不规则腺体、巢状和微乳头结构，以破坏性模式浸润在充足的促纤维增生基质组织中。
研究人员按进化状态对形态学结果进行分类，结果显示处于适应状态的 9 名患者中有 6 名患有输卵管卵巢肿瘤，其生长模式主要为 SET 型；此外，处于进化状态和高成纤维细胞成分的患者肿瘤在形态上几乎完全以单一浸润性腺乳头状生长模式生长。
5 基因组和转录水平上显示肿瘤进化状态具有不同的通路特征
148名患者的407份样本数据分析确定了进化状态之间突变路径的亚克隆差异、每种状态的富集生物通路、各状态之间的共享通路。每种状态特有的明显富集的癌症通路包括MAPK和ERBB2（进化状态）、PI3K/AKT（维持状态）以及NOTCH和WNT（适应状态），并通过RNA-seq验证（图A）。
同时研究人员分析了 NACT（35名患者的68份样本）后和复发时（24名患者的35 份复发样本）六个富集信号级联的稳定性。在维持组的肿瘤中，特异性 AKT 和 PI3K 信号传导在 NACT 后和复发时仍显著富集。但在所有患者中，尽管进行了所有治疗，AKT/PI3K 信号转导在复发时也显示出明显的富集（图B），表明其在肿瘤进展和化疗耐药中的关键作用。
通过嵌套路径分析，研究人员提出了两条进化轨迹。第一个轨迹中，处于进化状态的患者的肿瘤进展到维持状态，第二步进展到适应状态，这种转变以细胞因子信号转导、MET激活RAS和血管内皮生长因子信号级联通路的变化为标志；第二个轨迹中，处于进化状态的肿瘤可以绕过维持状态直接进化到适应状态，以WNT信号、PTEN调节的变化和细胞因子信号的激活为标志。
6 肿瘤类器官实验验证：阿培利司靶向富集的 PI3K/AKT 通路
进化状态的通路分析确定了HGSC患者中高度丰富的PI3K/AKT信号通路。该通路在维持状态的患者中丰富，其特点是临床结果不佳，并且在 NACT 后和复发时仍然丰富。已有研究表明，针对PI3K催化 p110 亚基可以产生抗癌作用，并可能有助于克服癌症的化疗耐药性。为了测试PI3K抑制剂的抗肿瘤作用，选择5个HGSC类器官，使用三种临床PI3K抑制剂：Alpelisib、Idelalisib和Umbralisib进行实验。药物治疗72h后，使用碘化丙啶染色测定类器官的死亡情况，观察到Alpelisib和Umbralisib在所有PI3K/AKT通路富集的类器官中具有显著的细胞毒性，表明所有被检测的类器官在其增殖过程中都依赖于PI3K/AKT通路，并且表明含有PI3K/AKT信号通路的类器官至少在一定程度上依赖于该通路。在所有样品中，Alpelisib对细胞活力的影响最强，而Idelalisib对细胞活力的影响最弱。这一实验验证了研究人员的假设，即PI3K抑制剂对富含PI3K突变的HGSC肿瘤具有更高的疗效。
四、结论
本项研究整合了 HGSC 肿瘤的基因组和转录组数据，进行克隆进化等分析，主要研究了高级别浆液性卵巢癌的进化状态和轨迹，发现了三种进化状态，并分析了其发展顺序。通过类器官实验证实了在肿瘤生长过程中PI3K/AKT通路的作用，表明PI3K抑制剂能够抑制HGSC肿瘤的生长。对于高级别浆液性卵巢癌的诊断和治疗具有重要意义，有望为患者提供更加个性化的治疗方案。
