文献解读：利用碱基编辑类器官导致囊肿发生揭示了多囊肾病的治疗策略

文章题目

Genetics of cystogenesis in base-edited human organoids reveal therapeutic strategies for polycystic kidney disease

第一作者：Courtney E. Vishy

通讯作者： Benjamin S. Freedman

通讯单位：华盛顿大学肾脏研究所和干细胞与再生医学研究所

杂志：Cell Stem Cell

影响因子：18.74/IF

DOI：10.1016/j.stem.2024.03.005

01 研究路线图

02 研究结果

1 碱基编辑产生具有无义突变的PKD hPSCs

选择四种临床记录的PKD无义突变作为hPSCs中CRISPR碱基编辑的靶向：PKD1R2430X、PKD1-Q3838X、PKD2-R186X和PKD2-R872X。

为了生成多个等位基因系列，采用了碱基编辑的同基因hPSCs，使用瞬时报告基因进行编辑富集（BIG-TREE），未编辑的C/C、杂合编辑的C/T和纯合编辑的T/T克隆均被鉴定为靶向PKD的突变，总共筛选了280个克隆进行编辑，并获得了每种基因型的多个克隆。

所有四种靶向PKD的无义突变体缺乏可检测的靶向PC1或PC2全长蛋白的表达，PKD1-R2430X和PKD2-R872X克隆分别表达截短形式的PC1和PC2。在每个等位基因系列中，PC1或PC2蛋白水平反映了它们的遗传剂量，在纯合子中没有检测到表达，突变体和杂合子中有50%表达。

2 具有纯合无义突变的肾脏类器官模型PKD

为了评估无义突变型hPSCs建模PKD的能力，首先将它们分化为肾类器官，在分化第18天达到成熟后，从贴壁培养中人工分离肾脏类器官并转移到悬浮培养中，在这种情况下，PKD无义突变的肾脏类器官高效地形成囊肿。

综上所述，PKD类器官囊肿由包含多个肾单位起源片段的大片管状上皮迅速产生。因此，具有一系列临床相关突变的碱基编辑类器官有力地再现了PKD表型。

3 杂合子抑制PKD囊肿发生

评估了PKD杂合与纯合突变类器官的表型，以及由胞嘧啶碱基编辑hPSCs队列生成的同基因对照。在两个等位基因系列中，与纯合子相比，PKD1或PKD2杂合的类器官即使在培养数周后也不会以显著的速率产生囊肿。

为了确定校正无义突变的遗传方法是否是PKD基因治疗的可行选择，采用CRISPR碱基编辑将突变碱基恢复为共有序列，利用Cas9介导的腺苷瞬时报告基因进行编辑富集（XMAS-TREE）方法来编辑hPSCs，通过Sanger测序，未编辑的PKD2-R186X纯合（A/A）和杂合基因校正鉴定了（A/G）克隆，筛选了76个克隆进行编辑，并获得了多个杂合克隆，通过免疫印迹分析蛋白质水平变化，其中PKD2-R186X将PC2丰度恢复至非突变水平的50%。

为了评估杂合校正hPSCs抑制PKD囊肿发生的能力，将hPSCs分化为肾类器官，考虑潜在的克隆变异性，对每个基因型使用了多个独立的克隆。在并行实验中，PKD2-R186X将囊肿发生率从未经编辑的纯合突变类器官的70%以上降低到杂合基因校正类器官的10%，同时囊肿横截面面积减少，与原始PKD2-R186X杂合类器官相比，基因校正的 PKD2-R186X杂合类器官形成囊肿的比率似乎略高。结果表明，单拷贝PKD1或PKD2的突变不足以在类器官中诱导囊肿表型。

4 ERSG治疗可减少PKD囊肿的形成

两种ERSG化合物：ELX-02和ELX-10，进行了测试，在PKD囊肿形成之前，将类器官放置在各个孔中，以便在14天的治疗时间过程中进行一致的跟踪。在使用任一ERSG化合物治疗后，所有四种靶向PKD突变中形成囊肿的类器官的百分比均出现剂量依赖性下降，当用ERSG处理时，形成囊肿的类器官的百分比降至25%以下，显著低于未经处理的类器官中观察到的75%。此外，在这两种治疗方法以及所有的突变体中，通过横截面积测量，囊肿大小呈剂量依赖性减小，在低剂量下，即使在对类器官百分比影响较小的情况下，仍然可以检测到囊肿面积的减少。

基于这些发现，在所有突变体中使用两种ERSG进行预防性功效测试期间，进一步分析了10至90 mM治疗范围内的毒性。在90 mM剂量下检测到毒性略有增加。

接下来，使用“治疗性治疗”方法测试了ERSG是否可以降低预先形成的囊肿的生长速度，其中在治疗开始之前允许类器官发育囊肿，在使用任一ERSG化合物治疗时，在所有四种靶向PKD突变中观察到囊肿面积倍数变化呈剂量依赖性下降；平均而言，在最高剂量下，ERSG治疗后囊肿生长趋于稳定。

有趣的是，与未经处理的类器官相比，单个类器官偶尔会表现出囊肿大小的减小（逆转），对于治疗测定，通过活/死染色或LDH释放测定未检测到实质性毒性。与囊肿前结构相比，在这些预先形成的囊肿中观察到的毒性降低，可能反映了囊肿发生过程中生理或代谢的变化。总的来说，这些研究表明ERSG在囊肿前和囊肿后阶段对PKD囊肿发生具有广泛的有益作用，且不会诱导显著的细胞毒性。

5 ERSG治疗靶向无义突变体

接着，试图通过监测ERSG治疗后无义突变肾类器官中PC1和PC2的表达，仅关注高达60 mM的剂量，与同基因对照相比，PKD2突变体中的PC1水平显著降低，反映了稳定PC1需要PC2，在所有PKD1或PKD2靶突变位点中，ERSG处理导致PC1表达呈剂量依赖性增加。在30 mM ELX-02处理浓度下，这种增加是等基因对照水平的50%。

之前观察到，PC1在PKD2/hPSCs和类器官中显著减少，在ERSG处理的PKD2无义突变体中，观察到PC1恢复到WT水平，表明PC2正在恢复。

为了测试类器官模型中的ERSG治疗反应是否对无义突变具有特异性，将ELX-02或ELX-10应用于由碱基编辑产生的纯合缺失突变衍生的类器官上，由于这些突变不适用于通读治疗，因此在处理类器官时，对囊肿的发生没有影响。进一步控制ERSG的脱靶效应，在分化的早期阶段将ELX-02添加到类器官培养物中，并观察到大小维持在10或30 um的肾囊泡结构正常生长直至终末分化。

综上所述，观察到的全长PC1蛋白的恢复以及对无义突变的治疗反应的特异性表明ERSG在类器官模型系统中具有靶向活性。

6 ERSG在肾类器官囊肿内积聚

由于没有带有荧光结合物的ELX药物，转而使用德克萨斯红庆大霉素（GTTR），这是一种与ELX-02和ELX-10结构非常相似的荧光团偶联氨基糖苷类药物。

在PKD类器官囊肿中，GTTR吸收到囊肿上皮细胞中需要几个小时的时间，在固定样本中，GTTR信号以细胞内定位模式存在于近端（LTL^hiECAD^lo）和远端 (ECAD^hiLTL^lo)细胞中。

为了测试GTTR体内积累，将GTTR注射到血管系统中，并立即采集肾脏并对其处理以进行荧光分析，这是使用Pkd1^RC/RC小鼠进行的，这些小鼠是PKD1亚型突变的纯合子，并发展为进展的PKD。组织切片分析显示，囊壁上皮细胞的子集容易积累GTTR。因此，ERSG能够积累于体内的PKD囊肿。

03 结论

本研究使用碱基基因编辑技术和类器官模型，建立了四种常见无义突变的等位基因系列中的人多能干细胞，当分化为肾类器官时，纯合突变体自发形成囊肿，而杂合突变体没有囊肿表型。研究确定了真核核糖体特异性糖苷（ERSG）作为多囊肾病（PKD）的治疗剂。两种不同的ERSG不仅可以防止囊肿的形成，还可以通过部分恢复多囊蛋白的表达来限制预先形成的囊肿的生长，此外，糖苷在类器官和小鼠的囊肿上皮中积累。本研究表明人多囊蛋白可作为药物开发和基因治疗靶点。

类器官

Organoids

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