化疗期间的获得性半鳞状化提示分化可作为膀胱癌的治疗策略
今天给大家分享一篇通过类器官构造肿瘤模型发掘潜在机制的文章。 文章思路：构建正常膀胱类器官—基因编辑膀胱类器官—膀胱类器官荷瘤小鼠模型-多组学测序-确定目标靶点-基因干扰过表达验证-药物抑制剂验证-得出结论。四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室陈崇教授、刘玉教授、魏强教授于2022年发表在CANCER CELL（50.3/Q1）上题为“Acquired semi-squamatization during chemotherapy suggests differentiation as a therapeutic strategy for bladder cancer”的文章。该研究基于类器官的方法构建了肌层浸润性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancers, MIBCs)的PDOX小鼠模型，并模拟了MIBC患者临床用药到产生化疗抵抗的过程，最终证明半胱氨酸蛋白酶CTSH与化疗抵抗和半鳞状分化密切相关，半鳞状分化是膀胱癌化疗耐药的一个新特征，进而提出靶向CTSH促进耐药肿瘤细胞终末分化的分化治疗策略。
研究项目背景：
近年来靶向治疗、免疫治疗等越来越多的新型肿瘤治疗方案进入临床，但化疗仍然是目前临床肿瘤治疗的主要手段。但大多数肿瘤或早或晚都会对化疗产生耐药性，从而复发和进展。目前肿瘤化疗耐受的分子机制尚待进一步解析。肌层浸润型膀胱癌(Muscle-invasive bladder cancer, MIBC)是最为常见和恶性的泌尿系统肿瘤，以顺铂为主的化疗是不可手术和转移性MIBC的一线治疗方案，而由于化疗耐药的产生，很大一部分患者会化疗失败，导致肿瘤复发和进展。
MIBC的动物模型较为缺乏，本研究中构建了p53和Pten缺失、Myc过表达的膀胱类器官模型、类器官原位的MIBC小鼠荷瘤模型。该模型能准确地表征MIBC患者的临床病理特征。利用该模型，团队测试了其对MIBC临床化疗方案(顺铂+吉西他滨)的反应，发现该模型能精准地呈现与临床相似的反应到复发耐药的全过程。
研究路线图
研究结果
1 肌层浸润型膀胱癌PDOX模型构建
获取小鼠的膀胱组织，在体外进行类器官的培养，并利用CRISPR-Cas9基因编辑在小鼠膀胱类器官中敲除Trp53、Pten，同时MYC过表达来驱动肿瘤的发生。将编辑过的类器官原位移植到免疫小鼠体内，构建原位MIBC小鼠模型。通过生物发光成像、磁共振成像可以观察到肿瘤逐渐长大，且小鼠出现血尿、膀胱增大等症状，并于2个月后死亡，病理切片发现肿瘤细胞出现大量浸润，表明该模型较好的模拟了MIBC的组织学特征。
对PDOX小鼠模型进行化疗药物顺铂联合吉西他滨处理，两轮治疗后肿瘤生长受到抑制，但继续治疗4-5轮后肿瘤开始复发。将复发的小鼠肿瘤（即抵抗的）及敏感的的小鼠肿瘤再次种植到新的受体小鼠中，发现再次化疗对于耐药的肿瘤几乎没有任何效果，表明该小鼠模型较好的呈现了MIBC临床治疗反应以及化疗后的耐药表型。 并且发现相比于敏感的肿瘤，在化学耐药的肿瘤中化疗抵抗相关的基因上调，同时鳞状细胞的markers丰度增加，表明药物抵抗的肿瘤开始出现鳞状分化。
2 单细胞RNA-seq分析发现化疗过程中细胞谱系的变化
在药物治疗后对敏感性肿瘤和耐药性肿瘤PDOX小鼠模型进行了单细胞RNA-seq，可将敏肿瘤群体分为两大类T1和T2。T1、T2两类细胞在敏感的肿瘤和耐药的肿瘤中分布的百分比不同，敏感肿瘤中T1亚群占主要部分，耐药肿瘤中T2亚群占主要部分。T2亚群可能是化学耐药的。将敏感肿瘤中的T1/T2分别命名为Sen-T1/T2, 耐药肿瘤中的两群分别命名为Res-T1和Res-T2。然后将T1,T2分别进行原位移植后，发现被种植Sen-T1的小鼠接受化疗后肿瘤被显著抑制，而被种植Res-T2的小鼠肿瘤仍然耐药。表明T1亚群确实对化疗敏感，T2群确实具有化学耐药性。而Sen-T2和Res-T1这两个亚群的细胞对化疗的反应介于Sen-T1和Res-T2之间。随后进行了化学耐药的进化轨迹分析，发现了肿瘤细胞在药物处理后经历了Sen-T1→Sen-T2→Res-T2的进化轨迹。
MIBC的PDX小鼠模型和患者的活检样品也观察到随着多次化疗，鳞状分化基因表达逐步升高的现象。对治疗前后MIBC患者的肿瘤组织进行单细胞RNA-seq检测，也观察到了类似小鼠模型中的T1和T2亚群分布和相似的肿瘤耐药进化轨迹以及逐步的鳞状分化表型，表明化疗后的MIBC在获得性耐药过程中发生了逐步的鳞状分化。
3 ATAC-seq、蛋白组学、RNA-seq等多组学发现CTSH与耐药性和鳞状分化密切相关
ATAC-seq、mRNA、蛋白组测序显示：耐药细胞中富集的通路都是与角质细胞分化，鳞状分化相关的通路，其中CTSH（一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶）表达随化疗耐药轨迹逐渐上调。通过在耐药的肿瘤中敲除CTSH显著抑制了耐药肿瘤的生长。反之，在敏感的肿瘤中过表达CTSH则使得肿瘤产生更强的耐药性，肿瘤更加恶化，且与鳞状分化基因表达呈正相关。这表明了CTSH的出现对于MIBC的化疗耐药及鳞状分化至关重要。
4 CTSH抑制剂E64特异性抑制化疗耐药MIBCs并诱导晚期鳞状细胞分化
CTSH的抑制剂E64，发现E64特异性地对耐药的肿瘤小鼠有很好的治疗效果，而对敏感型肿瘤没有作用。说明CTSH的抑制确实可以抑制耐药性肿瘤。E64治疗后的肿瘤中观察到大量角化珠结构，并高表达CK16+，提示鳞状细胞发生终末分化。通过RNA-seq和质谱分析发现，E64治疗后肿瘤中与角化相关信号和鳞状分化相关基因更加上调，与CTSH敲除的表型一致。在用E64抑制CTSH之后，耐药性被显著削弱，但鳞状分化相反分化更进一步。于是将肿瘤对化疗敏感到耐药谱系转变过程中的鳞状分化命名为半鳞状分化（semi-squamatization），耐药肿瘤加E64处理后呈现的终末鳞状分化称为完全鳞状分化。数据表明在化疗药物处理之后，肿瘤的药物抵抗性逐渐增加， CTSH的水平也逐步增加，到达半鳞状分化的状态，这个时候使用E64抑制CTSH, 肿瘤进一步发生完全分化，且药物抵抗性大幅减弱。这说明这个半鳞状化的特征与化学耐药密切相关，而抑制CTSH可以通过促进完全分化来杀死肿瘤。
5 TNF 通路是E64治疗MIBCs所必需的
CTSH的抑制可以激活TNF signaling，而TNF的激活会促进鳞状分化相关的基因并诱导耐药细胞发生焦亡。所以当使用E64抑制CTSH时，最后会导致细胞完全鳞状分化及细胞死亡。
本研究首先构建了基于基因编辑类器官的原位PDOX膀胱癌模型，重现了膀胱癌从化疗到产生耐药的全过程，并且发现了膀胱癌化疗耐受过程中出现的一种新的谱系状态，“半鳞状分化”是导致耐药出现的一个关键原因。而CTSH在肿瘤逐渐获得耐药性的过程中逐渐升高，CTSH抑制剂E64的使用，可通过激活TNF通路导致终末鳞状分化和细胞焦亡来抵消肿瘤的耐药性，从而达到更好的治疗效果。
