对于许多成人器官来说，慢性疾病期间的组织再生仍然是一个有争议的话题。再生过程在动物模型中很容易观察到，并且其潜在机制正在得到很好的表征，但技术挑战和伦理方面限制了这些结果在人类中的验证。本研究通过单细胞测序技术和肝胆管类器官模型验证了慢性肝病中细胞再生能力的获得过程和机制。
研究思路图
研究结果
01 snRNA-seq捕获MASLD中的肝细胞
代谢功能障碍相关脂肪变性肝病（MASLD）是一种进展性疾病。为了评估MASLD影响的肝脏是否表现出再生的证据，进行了免疫染色，比较健康肝脏和MASLD不同阶段肝脏的活检组织切片，观察到肝细胞标志物ALB或HepPar1，也观察到胆管细胞标志物ALB、K7和K19的表达，表明存在结合了肝细胞和胆管细胞表型的细胞。
最后，单核分析也揭示了肝细胞和胆管细胞标记物共表达细胞的存在。总之，以上结果证实了双表型细胞的存在，这些细胞以前曾与进展性MASLD患者的肝脏再生过程有关。
02 MASLD重塑肝脏微环境
在研究双表型细胞起源之前，先探索了每种细胞类型中发生的转录变化。UMAP显示，在终末期疾病中，所有类型的细胞都显示出差异表达基因，在终末期肝细胞群体显示出最强烈的转录变化。通过免疫染色和抗体染色全器官（FLASH）成像的3D快速光显微分析，表明肝细胞在转录和蛋白质水平上的带状丢失，但通过显示肝细胞逐渐获得共表达健康肝脏中相互排斥的区带标记的能力，也表明疾病进展强烈地改变了肝脏微环境，导致功能区带的丧失。
相应地，胆管细胞也表现出强烈的疾病特征，其特征是胆管反应标志物NCAM1和TNFRSF12A增加。同时，MASLD进展过程中胆管数量的增加，表明这一过程对肝脏结构有重大影响。为了证实这一假设，使用Flash技术对健康和终末期组织进行了3D胆管树成像，结果表明健康组织的K7染色显示了一个导管网络，形成了树状的分枝结构，而终末期组织在肝细胞结节周围显示复杂的篮状结构，这样的结构表明胆管细胞发生了深刻的重塑。综上所述，双表型细胞的出现可能与疾病进展过程中胆管树和肝脏微环境的重大重组有关。
03 肝细胞和胆管细胞的再生能力
接下来，通过对肝细胞和胆管细胞亚聚类来确定其起源，这些分析揭示了两个胆管细胞亚群，即来自表达MUC1的大胆管细胞和表达BCL2的小胆管细胞，表明确实捕获了胆管反应结构。此外，对胆管细胞群的聚类在簇5、9和1中鉴定出表达多种肝细胞标记物的细胞，对肝细胞的相同分析还表明，肝细胞簇9鉴定出表达多种胆管细胞标记物的细胞。因此，两种细胞类型都能够产生双表型细胞
值得注意的是，表达最高水平胆管细胞标志物的肝细胞在终末期疾病中更为常见，表明细胞再生能力可能随着疾病进展而发生，对胆管细胞进行的类似分析表明，胆管细胞簇1在终末期疾病中更为突出，而簇5和9也出现在早期阶段。总之，这些结果表明双表型细胞在疾病进展过程中出现，而转分化在疾病终末期更为突出。
04 再生能力因素
接下来，通过关注终末期细胞研究增加再生能力的机制，生成了一个仅包含终末期疾病的肝细胞和胆管细胞的UMAP，然后从肝细胞簇9的亚簇和胆管细胞簇1的亚簇中定位了双表型细胞。正如预期的那样，选定的细胞连接胆管细胞和肝细胞，证实了它们的转分化状态。
为了解决这种转分化的方向性，计算了这些细胞的RNA Velocity，胆管细胞样肝细胞表现出双向性，而肝细胞样胆管细胞显示出从胆管细胞到肝细胞的主要方向，因此，转分化似乎发生在两个方向上。总之，这些观察结果表明单核分析确定了终末期MASLD中标记转分化细胞的因素。
05 PI3K–AKT信号通路调节再生能力
为了进一步研究PI3K-AKT通路在调节胆管细胞和肝细胞再生能力分子机制中的功能重要性，利用肝内胆管类器官（ICOs），其可以在体外长时间生长，并保持其胆管特性和分化为表达肝细胞标记物细胞的能力。从末期MASLD肝脏中生成ICOs，这些细胞表达K19，证实了其胆管细胞的身份。然后MASLD ICOs分化为表达肝细胞标记物的类器官，MASLD ICOs分化产生的类器官含有ALB阳性细胞，定量PCR显示它们的CYP3A4、HNF4A和ALB表达增加，然而，类器官中只有部分细胞变成ALB+，而ALB+细胞也是K19+，表明分化过程是异质的并且类器官具有双表型特征。
接下来使用ICOs来验证PI3K-AKT信号传导的重要性。在mTOR抑制剂、PI3K抑制剂以及AKT抑制剂存在下，ICOs发生分化，显示肝细胞标志物表达显著降低；此外，在mTOR激活剂存在下ICOs的分化增强，表明该途径可以增加胆管细胞中肝细胞标记物的表达。这些数据共同表明，mTOR-PI3K-AKT途径可能是胆管细胞分化为双表型细胞所必需的，但对于这些细胞的生存而言并非必需。最后，观察到终末期肝脏的胆管细胞和肝细胞中YAP信号基因表达增加，在YAP激活剂存在的情况下进行分化，并观察到肝细胞标记基因表达的强烈下降，表明YAP-TAZ 途径可以限制胆管细胞的再生能力，但促进胆管反应。
总而言之，这些数据表明再生能力的获得可能涉及不同信号通路之间复杂的相互作用，包括YAP和PI3K-AKT-mTOR通路。
结论
在这里，对不同阶段的代谢功能障碍相关脂肪性肝病患者的47例肝活检进行了单核RNA测序（snRNA-seq），以建立疾病进展期间肝脏的细胞图谱。然后将这些单细胞水平的数据与先进的3D成像相结合，揭示肝脏结构的深刻变化。更重要的是，本研究揭示了在不存在成体干细胞或发育祖细胞激活的情况下肝细胞和胆管细胞之间发生的转分化事件；使用肝胆管类器官进行的详细分析和功能验证证实了PI3K-AKT-mTOR通路在此过程中的重要性，从而将这种再生能力的获得与胰岛素信号传导联系起来。总之，本研究表明慢性损伤创造了一个诱导人体器官细胞再生能力的环境，了解这一过程的潜在机制可以为慢性疾病的治疗开辟新的治疗途径。
